同位素標記電灑法質譜與串聯質譜於醣蛋白及牛奶寡醣變化之研究

出版年份: 
2013年
主題類別: 
關鍵字: 
摘要: 

實驗室先前發表了完整醣胜肽的相對定量策略,可以判定兩核醣核酸酶B樣品醣蛋白濃度、醣鏈分佈、醣化程度的變化。然而有多個醣化位置和複雜型醣鏈的醣蛋白更為常見,如果此相對定量策略可以應用於有多個醣化位置和複雜型醣鏈的醣蛋白,將會對醣蛋白分析非常有幫助。與之前的策略相比,此策略使用液相層析質譜、質量差較大的同位素標記(6 Da)及自然同位素貢獻的訊號修正。兩胰蛋白酶水解醣蛋白樣品分別與12C, H-甲醛和13C, D-甲醛反應標記2CH2和213CD2,混和後以纖維素微晶體純化,以液相層析質譜分析。從非醣化胜肽的2CH2和213CD2標記訊號可以得到醣蛋白濃度變化,比較醣化位置上2CH2和213CD2的醣鏈分佈可以得到醣鏈分佈變化,得到醣蛋白濃度變化與醣鏈分佈變化後,可以計算此醣化位置的醣化程度變化。配置兩個醣蛋白濃度(2倍變化)與醣化程度不同(100%與25%醣化程度)但醣鏈分佈相同,及兩個醣蛋白濃度與醣化程度相同但醣鏈分佈不同(原始的與β1-4 galactosidase處理的醣鏈分佈)的去唾液酸胎球蛋白樣品。對於唾液酸胎球蛋白,則配置兩個醣蛋白濃度(4倍變化)、醣化程度(100%與50%醣化程度)與醣鏈分佈(原始的與溫和酸性條件處理的醣鏈分佈)皆不同的樣品。結果發現得到的醣蛋白濃度變化、醣鏈分佈變化與醣化程度變化非常接近配置值。因此,此策略將可以應用於大部分醣蛋白的相對定量分析。
為了提升醣胜肽在質譜分析的感度,並進行準確的相對定量,在本研究中,開發一策略使用同位素標記及離子阱二次質譜,對醣胜肽進行相對定量。由於標記在胜肽端,因此為了進行相對定量,二次質譜偵測的碎片離子必須包含胜肽部分,在此策略中,運用離子阱二次質譜可以為醣胜肽帶來強度很高的包含胜肽端的碎片的優點,因此與三段四極柱或是三段四極柱-離子阱質譜儀相比,將可以帶來更好的感度。在離子阱二次質譜偵測時,偵測的碎片離子為胜肽加一個GlcNAc與另兩個強度最高的包含胜肽端的碎片離子。結果發現使用二次質譜分析去唾液酸胎球蛋白與唾液酸胎球蛋白醣胜肽與一次質譜相比,得到了1.6 - 52.9倍S/N提升。使用二次質譜偵測2CH2及213CD2標記去唾液酸胎球蛋白與唾液酸胎球蛋白的胰蛋白酶水解混和物,由2CH2及213CD2標記碎片離子的訊號,可以得到非常接近配置的輕與重標記濃度比例的結果。由以上結果,證實同位素標記與離子阱二次質譜可以提供醣胜肽靈敏並且準確的相對定量方法。
牛乳寡醣是非常複雜的同分異構物混和物,寡醣同分異構物其單糖組成相同只差在單糖鍵結點不同,然而其異構物在新生兒腸道內的生理功能可能完全不同。在本研究中,使用實驗室先前發表的對胺基苯甲酸乙脂(ABEE)閉環標記,來分析牛乳寡醣同分異構物。將牛乳寡醣純化後,閉環標記ABEE,將衍生物再經純化後,以C18毛細液相層析負離子串聯質譜分析ABEE標記寡醣。使用ABEE標記寡醣的特徵裂解離子偵測寡醣,因此對於異構物的分析,除了可以使用液相層析將時間分開,也可以使用串聯質譜將質量分開。在本研究中取得了牛分娩1 - 4天的牛初乳,將1 - 4天初乳各加入Glc4標準品,分析Glc4訊號得到前處理方法的再現性約8%,並對牛奶中含量豐富且報導有生理功能的寡醣異構物包括3GalNL、6GlcNL、LNT、LNnT、LNnH、3SL、6SL、3SLN、6SLN、3S6GL、6S3GL及DSL進行哺乳期的含量分析。其中,LNT在哺乳期間的含量變化為第一次在本研究中被報導。